Разделы







Лабораторные критерии для постановки диагноза ВИЧ-инфекции.

Основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к вирусу с помощью ИФА. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% зараженных в течение 3 мес. после заражения, у 5-9% – через 6 мес. от момента заражения и у 0,5-1% – в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения анти­тел – 2 нед. от момента заражения. В терминальной фазе СПИД количество антител может значительно снижаться, вплоть до пол­ного их исчезновения. Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции на первом этапе строится на выявлении суммарного спектра анти­тел против антигенов ВИЧ с помощью твердофазного иммунофер-ментного анализа. На втором этапе методом иммунноблоттинга (Western blot) проводится определение антител к отдельным белкам вируса.

Иммуноферментный анализ.

Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген – антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата. Основной компонент твердофазных иммуноферментных тест-систем – полистироловый планшет с лунками или полистиро­ловые шарики, на поверхности которых сорбирован антиген: ви­русный лизат, рекомбинантные белки или синтетические антиген­ные детерминанты. Из всех модификаций твердофазного ИФА для диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, наиболее широко при­меняют непрямой и контактный варианты.

Принципы постановки непрямого метода ИФА.

Предварительно приготовленный согласно инструкции, прила­гаемой к набору, исследуемый материал (сыворотка, плазма) вно­сится в лунку планшета. Если этого требует методика, планшет пред­варительно отмывается. Несколько лунок планшета заполняют кон­трольными сыворотками, содержащими и не содержащими антите­ла к ВИЧ. При работе с контрольными сыворотками необходимо строго соблюдать инструкции по применению диагностической тест-системы, т. к. интерпретация результатов зависит от значений опти­ческой плотности контрольных сывороток. Планшет с внесенными контрольными сыворотками и исследуемым материалом инкубиру­ется при условиях, указанных в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Если специфические антитела присутствуют в сыворотке, они образуют комплекс с антигеном, сорбированным на поверхности лунок планшета. Несвязавшиеся с антигеном анти­тела удаляются при отмывке планшета.

Затем во все лунки планшета вносят конъюгат-антитела против иммуноглобулинов человека, меченные ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.). При последующей инкубации происхо­дит образование комплекса антиген – антитело – конъюгат. Несвя­завшийся конъюгат удаляется во время отмывки планшета. Наибо­лее широко применяемым индикаторным ферментом для ИФА слу­жит пероксидаза хрена. Субстраюм для нее служит перекись водо­рода.

Эта реакция протекает без видимых проявлений. Изменение ок­раски раствора происходит при окислении красителей (ортофени-лендиамина или др.), которые входят в состав субстратного раство­ра. Краситель из восстановленной формы переходит в окисленную окрашенную форму. Таким образом происходит окрашивание толь­ко тех лунок, в которых присутствует комплекс антиген – антите­ло – конъюгат. Иногда окрашивание может быть результатом не­специфического связывания иммуноглобулинов с антигенами ВИЧ. Учет реакции проводят на спектрофотометре (ридере) при длине волны, указанной в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Длина волны зависит от красителя, используемого в тест-системе.

При постановке ИФА в случае получения положительного ре­зультата анализ проводится еще 2 раза (с той же сывороткой). При получении хотя бы еще одного положительного результата сыво­ротки направляют в референс-лабораторию.

Иммунный блоттинг.

В настоящее время для подтверждения специфичности первично­го положительного результата чаше всего используется метод иммунноблоттинга. Принцип метода заключается в выявлении анти­тел к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. В организме человека образуются антитела к ряду компонентов вируса.

Подготовка нитроцеллюлозных мембран для тест-системы про­изводится следующим образом. На первом этапе производят разде­ление белков ВИЧ по молекулярной массе с помощью электрофо­реза в полиакриламидном геле. Белки мигрируют в слоях геля при наложении электрического потенциала: белки с низкой молекуляр­ной массой проходят через поры в полиакриламидном геле легче, чем белки с высокой молекулярной массой и быстрее достигают конца геля. В результате этого происходит разделение белков на отдельные полосы по молекулярной массе. Затем осуществляется электрофоретический перенос из полиакриламидного геля на поверх­ность нитроцеллюлозной мембраны. После этого мембрану обраба­тывают блокирующим раствором во избежание неспецифического связывания иммуноглобулинов сыворотки крови, затем отмывают, высушивают и разрезают на отдельные полоски, которые вклады­ваются в набор. Перенесенные таким образом белки выявляются на нитроцеллюлозной реплике (блоте) с помощью непрямого анали­за, а именно: сыворотка или плазма инкубируются с блотом; если исследуемый материал содержит антитела к белкам ВИЧ, они свя­зываются с антигеном, перенесенным на нитроцеллюлозную мемб­рану, после отмывки полоски блота инкубируются с конъюгатом; при образовании комплекса антиген – антитело, конъюгат присое­диняется к нему, после отмывки от конъюгата и инкубации с суб­стратом происходит окрашивания тех участков нитроцеллюлозы, где произошло образование комплекса антиген – антитело – конъ­югат. Полученный результат сравнивается с результатами тестиро­вания положительной и отрицательной контрольных сывороток.

Страницы: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Смотрите также

Инновационный менеджмент
Появление в учебных планах российских вузов дисциплины «инновационный менеджмент» продиктовано требованиями жизни. В научно-технической и социально-экономической сферах наблюдаются тенде ...

Безопасность функционирования технологической системы
Безопасность функционирования технологической системы определяется не только состоянием самой системы, но и правильной работой всего персонала, обслуживающего систему. Главным виновником несчастных ...

Лечебные свойства алоэ
Алоэ известно всем и встретить его можно практически в каждом доме. Родиной этого вечнозеленого растения считается Африка. В настоящее время в мире существует более 300 разновидностей алоэ. Любой ...